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本制品是一种采用了经过改造和优化的BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)，用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。

采用本试剂盒可以合成长达13kb的cDNA第一链。在采用BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)的情况下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。

试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。试剂盒中提供的Control Primer为17聚，即引物的长度为17个碱基。试剂盒中提供的Control RNA为带有3’poly(A)的1.1kb RNA。

• 对于GC含量比较高的RNA的反转录，试剂盒的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
  
  • 参考如下表格设置反转录反应：
    

    成分		用量
    模板(后面4种任选一种)	Total RNA	0.01～5μg
    	或Poly(A) RNA/mRNA	1～500ng
    	或Specific RNA	0.01pg～500ng
    	或Control RNA	2μL
    引物(后面3种任选一种)	Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl)	1μL
    	Random Hexamer Primer (0.2μg/μL)	1μL
    	Gene specific primer	15-25pmol
    DEPC-treated Water		To 12μL
    70℃孵育5分钟，随后立即放置到冰浴冷却，4℃微离心
    Reaction Buffer(5X)		4μL
    RNase Inhibitor(20U/μL)		1μL
    dNTP Mix (10mM each)		2μL
    BalbRT M-MuLV反转录酶		1μL
    总体积		20μL

    
    
    
  • 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
    
  • 如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。
    注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。
    
  • 70℃孵育10分钟以失活BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。
    说明：对于长片断的cDNA不推荐采用加热的方法失活BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)，这种操作可能会导致部分长片断DNA被剪切。
    
  • 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为50μL，则推荐使用2μL反转录产物。
• 其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。

• RNA反转录产物电泳观察不到。
  反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
  
• 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
  PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。